蛋白质是生命体的核心构筑基元，其序列组成、空间构象及翻译后修饰共同构成了远超基因组复杂性的蛋白质组信息。发展高灵敏度的新型单分子蛋白质测序技术，是后基因组时代蛋白质组学领域亟待解决的核心难题。纳米孔核酸测序技术的成熟迭代，推动着研究人员将这一检测体系延伸至蛋白质测序领域。然而，蛋白质组存在多重分析难点，蛋白易自发折叠形成高级结构，加之20种氨基酸、海量翻译后修饰与剪切变体并存，大幅提升了序列识别的信息负荷，使得可靠、普适化的纳米孔蛋白测序方案至今难以落地。
天然蛋白质经可控水解后，会生成游离氨基酸、长短肽与修饰肽共存的混合体系，这些水解片段提供了一个极具信息挖掘价值的分析窗口，将大分子蛋白质的复杂解析难题转化为一系列相对较短、结构更易解构的肽段识别问题，为单分子蛋白质组分析提供了可行思路。近日，我院黄硕教授团队开发出一套新的纳米孔肽分析策略（图1）。首先在耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）纳米孔的收缩区域定点修饰单个次氮基三乙酸-镍适配器，随后依托镍离子与肽链N端的螯合配位作用，实现肽的特异性锚定识别（图1a）。区别于传统的肽穿孔检测模式，这种锚定机制有效抑制了肽的无规则热运动，显著延长了肽信号的持续时间，解决了短肽因易位速度过快而难以分辨的行业痛点，可产生辨识度极高的特征电流信号。
依托这一高分辨传感基础，研究团队引入了内肽酶对目标肽进行可控酶切，不同水解片段对应专属的纳米孔信号，组合形成独一无二的肽指纹图谱，无需数据库即可完成肽的快速鉴定（图1b）。研究进一步搭建了纳米孔肽事件数据库，通过比对多酶酶切产生的重叠片段的特征事件，成功组装出肽的原始序列（图1c），同时可精准定位单氨基酸突变、缺失与翻译后修饰位点等。
图1：基于工程化MspA纳米孔的肽段检测与序列解析策略。
这套传感平台可同步识别氨基酸与肽，检测范围覆盖单氨基酸至39个氨基酸长度的多肽。单一体系可同步区分73种蛋白组相关分析物（图2），涵盖天然氨基酸、翻译后修饰氨基酸、线性肽、环肽、生物活性肽、翻译后修饰肽、肿瘤新抗原等。基于多维度电信号特征构建的机器学习分类模型，整体验证准确率可达97.4%。后续扩充数据库规模时，识别精度仍可稳定保持，可适配多元化蛋白组的检测需求。
图2：纳米孔对氨基酸、肽、翻译后修饰等73种分析物的广谱检测。
该工作以“High-resolution nanopore peptide sensing, profiling and sequence assembly”为题，于2026年6月15日在《Nature Nanotechnology》发表相关论文（论文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-026-02192-3）。我院黄硕教授为该论文唯一通讯作者，课题组博士后王可凡为该论文第一作者。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院的重要支持，科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费、中国博士后科学基金会等经费支持。